Das Forschungsteam unter der Leitung von Professor Yao Honghong von der Southeast University hat den molekularen Mechanismus aufgedeckt, durch den CircHECW2 die Expression von WTAP und GNG4 reguliert und so die Funktionsstörung von Astrozyten kontrolliert

Zirkuläre RNAs (circRNAs), eine Art nicht-kodierender RNA, entstehen durch nicht-kanonische Backspleißvorgänge und sind im zentralen Nervensystem (ZNS) stark exprimiert. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass sie an vielen pathologischen und physiologischen Prozessen beteiligt sind.

Im April 2024 veröffentlichte das Forschungsteam um Professor Yao Honghong von der Southeast University einen Artikel mit dem Titel „Engagement of N6-methyladenisine methylation of Gng4 mRNA in astrocyte dysfunction regulated by CircHECW2“ in der Fachzeitschrift Acta Pharmaceutica Sinica B (IF = 14,5). Darin stellten die Autoren fest, dass der Spiegel der zirkulären RNA HECW2 (circHECW2) im Plasma von Patienten mit schwerer depressiver Störung (MDD) und im Mausmodell für chronischen, unvorhersehbaren Stress (CUS) signifikant erhöht war. Insbesondere konnte die Herunterregulierung von circHECW2 Astrozytenfunktionsstörungen und CUS-induzierte depressionsähnliche Verhaltensweisen lindern. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Herunterregulierung von circHECW2 die Expression der Methyltransferase WTAP erhöhte, was zu einer erhöhten Expression von Gng4 durch m führte.⁶Eine Modifikation, die funktionelle Einblicke in die Korrelation zwischen circHECW2 und m lieferte⁶Eine Methylierung. Dies deutet darauf hin, dass circHECW2 ein potenzielles Ziel für die Behandlung von MDD darstellen könnte.

circHECW2 ist bei CUS-Mäusen und MDD-Patienten hochreguliert

Es ist bemerkenswert, dass LPS- und CUS-induzierte Modelle der Depression sind in Studien gut dokumentiert, die für Depression. Der Autor Eine frühere Studie zeigte erstmals dass die circHECW2-Werte im Hippocampus von LPS erhöht waren behandelt Mäuse. Um die mögliche Beteiligung von circHECW2 bei Depressionen (Abb. 1C und D), der Autor isolierte den Hippocampus und gesammeltes Plasma von CUS-Mäusen. Als nächstes untersuchte der Autor die circHECW2-Werte im Plasma von MDD-Patienten und gesunden Kontrollpersonen und stellte fest, dass die circHECW2-Werte bei MDD-Patienten deutlich erhöht waren (Abb. 1E). Insbesondere ergab unsere Analyse eine positive Korrelation zwischen den circHECW2-Werten und den Werten der Hamilton Rating Scale for Depression 24 Items (HAMD-24) (Abb. 1F), den Werten der Montgomery-Asberg Depression Rating Scale (MADRS) (Abb. 1G) und den Werten der Hamilton Anxiety Scale (HAMA) (Abb. 1H). Darüber hinaus stellte der Autor durch lineare Regressionsanalyse fest, dass MDD-Patienten mit erhöhten circHECW2-Expressionsniveaus und hohen Punktzahlen im Fragebogen zu Kindheitstraumata (CTQ) schwerere Depressionssymptome zeigten (Abb. 1J). Um die Vorhersagekraft der circHECW2-Werte für MDD-Ergebnisse zu beurteilen, untersuchte der Autor die Veränderungen des circHECW2-Wertes zwei Wochen nach der Behandlung im Plasma von MDD-Patienten und stellte fest, dass der circHECW2-Wert zwei Wochen nach der Behandlung im Plasma von MDD-Patienten gesunken war (Abb. 1K).

Die Herunterregulierung von circHECW2 verbessert die durch CUS induzierten Verhaltensweisen

Nach einer zweiwöchigen Mikroinjektion untersuchte der Autor die Wirksamkeit der lentiviralen Transduktion und stellte fest, dass die Expression von circHECW2 bei mit shRNA-circHECW2 injizierten Mäusen verringert war (Abb. 2C). Verhaltenstests, darunter der Saccharosepräferenztest (SPT), der Forced Swim Test (FST) und der Tail Suspension Test (TST), wurden eingesetzt, um die Wirkung von circHECW2 zu bewerten. Die Saccharosepräferenz der mit CUS behandelten Mäuse war verringert, was auf Anhedonie hindeutet. Erfreulicherweise konnte dieses Defizit durch die Herunterregulierung der circHECW2-Expression signifikant gemildert werden (Abb. 2D). Sowohl im FST als auch im TST war die Zeit der Immobilität bei den CUS-Mäusen deutlich verlängert, und diese Effekte waren bei mit shRNA-circHECW2 injizierten Mäusen deutlich gemildert (Abb. 2E und F).

Rolle von circHECW2 bei der Astrozytenfunktionsstörung im Hippocampus von CUS-Mäusen

Anschließend untersuchte der Autor den zellulären Mechanismus, durch den circHECW2 die funktionelle Erholung nach CUS beeinflusst. Um die Zelltypen, in denen die Expression von circHECW2 hochreguliert ist, weiter zu untersuchen, hat der Autor die Expression von circHECW2 in Astrozyten, Mikroglia, Neuronen und Endothelzellen aus dem Gehirn von CUS-Mäusen nachgewiesen (Abb. 3A). Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Hochregulierung von circHECW2 aus Astrozyten in CUS im Vergleich zu circHECW2 aus Mikroglia-, neuronalen oder Endothelzellen (Abb. 3B). Zusätzlich zeigte die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsfärbung, dass circHECW2 in Astrozyten reichlich vorhanden war (Abb. 3C). Darüber hinaus milderte die Behandlung mit shRNA-circHECW2 den Rückgang der GFAP-Expression bei CUS-Mäusen signifikant (Abb. 3D und E). Anschließend entdeckte der Autor die Funktion von shRNA-circHECW2 auf dem Astrozyten’s Morphologie mittels GFAP und 3D-Rekonstruktion (Abb. 3F). Die Sholl-Analyse ergab, dass die Astrozytenfunktionsstörung durch CUS verursacht wurde, was durch eine Verringerung der Anzahl, Länge und des Volumens der Astrozytenzweige belegt wurde. Wichtig ist, dass diese Defizite durch die Behandlung mit shRNA-circHECW2 deutlich verbessert wurden (Abb. 3GeI). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die abnormale Hochregulierung von circHECW2 in Astrozyten ein kritisches molekulares Ereignis im Fortschreiten einer Depression darstellen könnte.

circHECW2 hemmt m⁶Eine Methylierung durch Herunterregulierung von WTAP

Angesichts der potenziellen Rolle von m⁶Eine Methylierung in MDD und die gegenseitige Regulierung zwischen circRNAs und m⁶Eine Methylierung, begannen wir mit einer Untersuchung, um festzustellen, ob circRNA’Die regulatorische Rolle von m6A in den pathologischen Prozessen der Depression, insbesondere in Astrozyten-vermittelten Mechanismen, beinhaltet m6A-Modifikationen. CUS führte zu einem Rückgang der m6A-Werte im Hippocampus, ein Effekt, der durch shRNAcircHECW2 deutlich gemildert wurde, was auf eine Regulierung von circHECW2 auf m hindeutet.⁶Eine Methylierung (Abb. 4A). Als nächstes haben wir die Expression der oben genannten m6A-modifizierenden Enzyme in CUS-Mausmodellen sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gemessen und festgestellt, dass nur der Proteinspiegel von WTAP im Hippocampus von CUS-Mäusen reduziert war (Abb. 4B). Anschließend verwendeten wir für weitere Untersuchungen primäre Maus-Astrozyten, die mit shRNA-circHECW2-Lentivirus oder circHECW2-überexprimiertem Plasmid transduziert wurden (Abb. 4C und D). Die Expression von WTAP war in mit shRNA-circHECW2 behandelten Zellen signifikant erhöht (Abb. 4E), während die Western-Blot-Analyse ergab, dass circHECW2 die Spiegel von METTL3, METTL14, FTO und ALKBH5 nicht veränderte, was auf eine spezifische Assoziation zwischen circHECW2 und WTAP hindeutet. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden primäre Astrozyten mit dem circHECW2-überexprimierten Plasmid transduziert und WTAP wurde in Astrozyten signifikant verringert (Abb. 4F). Als nächstes wurde ein Pulldown-Assay verwendet, um die Interaktion zwischen circHECW2 und WTAP zu untersuchen, und circHECW2 zeigte eine stärkere Affinität zu WTAP (Abb. 4G). Darüber hinaus zeigten In-vivo-Experimente, dass shRNA-circHECW2 die Abnahme von WTAP-Expression induziert durch das CUS-Modell (Abb. 4H). Um zu untersuchen, warum WTAP nach CUS abnahm, nutzten wir Immunpräzipitation zum Nachweis der Ubiquitinierung. Der Lysin-48-gebundene Ubiquitinierungsgrad (Ub-K48) von WTAP wurde durch circHECW2-Knockdown im CUS-Modell signifikant verringert (Abb. 4I).

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von circHECW2 und WTAP auf das Überleben von Astrozyten. Corticosteron wurde verwendet, um die Depression in vitro zu simulieren. Mit shRNAcircHECW2 transduzierte Astrozyten zeigten eine Verbesserung der durch Corticosteron induzierten verminderten Lebensfähigkeit (Abb. 4J). Im Gegensatz dazu verstärkte der Knockdown der WTAP-Expression die verringerte Lebensfähigkeit der mit Corticosteron behandelten Astrozyten signifikant (Abb. 4K). Darüber hinaus wurde die durch WTAP-siRNA verringerte Lebensfähigkeit der Astrozyten durch shRNA-circHECW2 gemildert, was auf eine enge Beziehung zwischen circHECW2 und WTAP hindeutet (Abb. 4L). Zusätzlich konstruierten wir ein hirn-astrozytenspezifisches AAVGFAP-WATP-Knockdown-Virus (KD). Drei Wochen nach der Mikroinjektion von AAV-GFAP-WATP-KD und shRNAcircHECW2-Lentivirus in den Hippocampus wurden die Mäuse einer CUS- oder Kontrollgruppe unterzogen. Verhaltensexperimente, einschließlich SPT, FST und TST, wurden nach vierwöchiger CUS-Exposition untersucht.

WTAP reguliert m⁶Eine Modifikation der Gng4-mRNA bei Depressionen

Um das potenzielle Downstream-Molekül zu suchen, das an der CUS-Maus beteiligt war, veröffentlichte der Autor eine transkriptomweite Erkennung von m⁶Eine Veränderung im Hippocampus der CUS-Maus in einer früheren Studie. Die Analyse biologischer Prozesse der Genontologie (GO-BP) zeigte, dass die herunterregulierten Gene mit Genbegriffen angereichert waren, die mit dem zellulären Prozess assoziiert sind. Die Region der mRNA mit verändertem m⁶Eine Modifikation (herunterregulierte Gene) (Abb. 5B). Anschließend wurde eine RNA-Sequenzanalyse im Hippocampus des CUS-Mausmodells durchgeführt. Wir identifizierten 288 Gene, die in der RNA-Sequenzanalyse differenziell exprimiert wurden (Cuffdiff-adjustierter P-Wert<0,05) (Abb. 5C). Besonders interessant ist, dass es zwischen den beiden Vergleichen 19 überlappende Transkripte gab (Abb. 5D), was darauf hindeutet, dass diese Gene die Zielgene sein könnten, die an der Astrozytenfunktionsstörung nach CUS beteiligt sind. Bemerkenswerterweise wurden diese 19 überlappenden Transkripte auf mRNA-Ebene verifiziert. In den 4 hochregulierten Transkripten wurde kein Gen validiert. Darüber hinaus war GNG4 im Plasma von MDD-Patienten signifikant verringert. Darüber hinaus gab es eine negative Korrelation zwischen GNG4 und den Werten der HAMD-kognitiven Beeinträchtigung. Auf Grundlage dieser Erkenntnisse erwies sich GNG4 als zentraler Schwerpunkt unserer MDD-Studie. Darüber hinaus analysierten wir den Signalweg, der GNG4 einbezieht, und seine Verbindung mit verringertem m⁶Eine Modifikation der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Abb. 5E). Weitere Ergebnisse zeigten, dass die m6A-Modifikation im Peakbereich (chr13: 13825437e13825707) im 30-UTR der Gng4-mRNA abnahm (Abb. 5F und G). Der Autor verwendete Luciferase-Assays, um den Wildtyp (WT) und den Mutanten m zu vergleichen⁶A-Stellen mit und ohne WTAP-siRNA-Behandlung. Diese Untersuchungen zeigten, dass die Mutation die Methylierung verhinderte und die Stabilität der Gng4-mRNA erhöhte (Abb. 5H). Wie erwartet linderte die Überexpression von Gng4 die verminderte Lebensfähigkeit der mit Corticosteron behandelten Astrozyten deutlich (Abb. 5I).

CircHECW2 reguliert die m6A-Methylierung von Gng4-mRNA über WTAP

Darüber hinaus untersuchte der Autor die Expression und Funktion von GNG4 im CUS-Mausmodell. Die mRNA- und Proteinspiegel von Gng4 waren im Hippocampus von CUS-Mäusen signifikant verringert, was mit der verringerten m6A-Modifikation von Gng4 übereinstimmte (Abb. 6A und B). Um außerdem die Beziehung zwischen Gng4-Werten und WTAP zu verstehen, wurde WTAP-siRNA in primäre Astrozyten von Mäusen transfiziert. Die Expression von GNG4 und Gng4-mRNA ist insgesamt verringert (Abb. 6C). Darüber hinaus führte die Hochregulierung von circHECW2 zu reduzierten mRNA- und Proteinspiegeln von Gng4 (Abb. 6D). Umgekehrt erhöhte die Herunterregulierung von circHECW2 in Astrozyten die mRNA- und Proteinspiegel von Gng4 (Abb. 6E). Die Kotransfektion von WTAP-siRNA und shRNAcircHECW2 ergab, dass WTAP-siRNA den GNG4-Spiegel senkte, was durch shRNA-circHECW2 deutlich gemildert wurde (Abb. 6F). Um diese In-vitro-Befunde zu validieren, wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, um die GNG4-Werte in mit shRNA-circHECW2 behandelten CUS-Mäusen zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass Die Behandlung mit shRNA-circHECW2 milderte den bei CUS-Mäusen beobachteten Rückgang der GNG4-Expression signifikant (Abb. 6G und H). Wir haben außerdem ein hirn-astrozytenspezifisches AAV-GFAP-Gng4-KD-Virus konstruiert. Drei Wochen nach der Mikroinjektion von AAV-GFAP-Gng4 KD und shRNA-circHECW2-Lentivirus in den Hippocampus wurden die Mäuse CUS ausgesetzt oder in einem Kontrollzustand gehalten. Die Ergebnisse von SPT, FSF und TST zeigten, dass astrozytäres Gng4 an der Regulation von circHECW2 bei Depressionen beteiligt ist (Abb. 6IeK).

Die funktionelle Konnektivität des Hippocampus zum präfrontalen Kortex korrelierte bei MDD-Patienten positiv mit GNG4

Abschließend wurde die Seed-to-Voxel-Analyse (funktionelle Konnektivität des Hippocampus) durchgeführt. Sie zeigte eine funktionelle Konnektivität (FC) des Hippocampus mit dem präfrontalen Kortex (PFC) bei MDD-Patienten. Wie in Abb. 7A–C dargestellt, war die FC zwischen Hippocampus und präfrontalem Kortex bei MDD-Patienten im Vergleich zu den GK signifikant reduziert. Als nächstes stellten wir eine bemerkenswerte Abnahme der funktionellen Konnektivität im Ruhezustand (rsFC) zwischen dem Hippocampus und dem dorsolateralen präfrontalen Kortex fest (Abb. 7D), während andere Gehirnregionen wie der visuelle Kortex und der untere Temporallappen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen. Darüber hinaus stellten wir eine positive Korrelation zwischen GNG4-Werten und rsFC fest, was darauf schließen lässt, dass GNG4 eine Rolle bei der kognitiven Gehirnfunktion von Personen mit MDD spielen könnte (Abb. 7E).

Zusammenfassung

Unsere Studie zeigte, dass die Hochregulierung von circHECW2 zu einer Abnahme der Gng4-mRNA über WTAP-vermittelte m führte⁶Eine Modifikation, die eine nachfolgende Astrozytenfunktionsstörung verursachte. Insbesondere förderte circHECW2 den Ubiquitin-vermittelten Abbau von WTAP im CUS-Mausmodell, und die Wirkung von GNG4 auf die Aufrechterhaltung normaler Astrozytenfunktionen wird aufgehoben, wenn WTAP in Astrozyten herunterreguliert wird. Daher reguliert die circHECW2/WTAP/GNG4-Achse die Astrozytenfunktionsstörung, indem sie die GNG4-Stabilität über eine WTAP-vermittelte m6A-Modifikation verringert. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass circHECW2 ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für die Behandlung von Depressionen darstellt. Darüber hinaus beleuchtet unsere Studie den funktionellen Zusammenhang zwischen circHECW2 und m⁶Eine Methylierung, die neue Erkenntnisse für die Entwicklung von Präventionsstrategien und wirksamen Behandlungen für MDD bietet.